Trabajos finales de carrera de grado
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Estos trabajos de fin de carrera son obras producidas por estudiantes, que se originan en los procesos formativos de la universidad.
Tienen propósitos culturales y educativos. No son productos comerciales y su difusión pública no está autorizada.
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Browsing Trabajos finales de carrera de grado by Author "Abreu Olano, Cecilia"
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Item Caracterización de los mecanismos moleculares que inducen la sobreexpresión del oncogén Musashi2 en pacientes con leucemia linfoide crónica(Universidad ORT Uruguay, 2022) Querol Rivas, Juliana; Palacios Pereira, Florencia Leticia; Prieto Mena, Daniel; Abreu Olano, CeciliaLa Leucemia Linfoide Crónica (LLC) causa un incremento lento de los linfocitos B y un desequilibrio entre la proliferación y la muerte celular. La LLC es considerada una enfermedad incurable en la que se necesita una mayor comprensión de los mecanismos que promueven la progresión de la enfermedad. Los altos niveles de Musashi2 (MSI2), proteína de unión al ARN, se han asociado con mal pronóstico en varios cánceres, incluido la leucemia linfoide crónica (LLC). El grupo de trabajo describió una sobreexpresión de MSI2 en pacientes con LLC comparados con donantes sanos, elevados niveles de MSI2 en los pacientes que presentan peor pronóstico clínico. Bloquear la función de MSI2 elimina las células tumorales de LLC, por lo tanto, entender los mecanismos moleculares que inducen y mantienen altos niveles de expresión son importantes para el diseño de una nueva estrategia terapéutica. En este trabajo final de carrera se propone estudiar posibles mecanismos moleculares que inducen y/o mantienen altos niveles de MSI2 en la LLC. En las muestras de tres pacientes progresores de LLC, la inhibición de NOTCH1 redujo la expresión de MSI2. En otro paciente progresor se determinó que a bajas concentraciones del inhibidor de NOTCH1 aumenta la expresión de KLF4 y reduce la de MSI2. A altas concentraciones del inhibidor, no se ve efecto en KLF4, aunque si en MSI2. Los resultados sugieren que la vía NOTCH1/KLF4 podría estar involucrada en la expresión de MSI2, aunque más pacientes deben ser evaluados para confirmar la hipótesis.Item Diseño y evaluación del proceso productivo de un antígeno recombinante de interés industrial(Universidad ORT Uruguay, 2022) Hounie Giménez, Camila; Becco Sierra, Lorena Lourdes; Marizcurrena Larroca, Juan José; Rodriguez Auge, Sebastian Marcelo; Abreu Olano, CeciliaEn el presente trabajo final de carrera se plantea diseñar el proceso productivo de un antígeno recombinante de interés industrial a escala de laboratorio y piloto para la empresa OLONIR S.A. El antígeno fue expresado en E. coli BL21(DE3) en forma de tres variantes: sin modificaciones, en fase con etiqueta de histidinas y sin cisteínas. Las condiciones de expresión del antígeno se pusieron a punto en la plataforma tecnológica de la empresa, logrando la expresión proteica en cuerpos de inclusión (CI) con rendimientos de 1,0-1,4 g/L a escala laboratorio y 2,23 g/L a escala piloto. Se optimizó el proceso de purificación y acondicionamiento (“downstream”), tomando como punto de inicio un proceso de purificación desarrollado por la empresa, sobre el cual se realizaron adaptaciones y mejoras, logrando obtener la proteína con un grado de pureza mayor al 80%. Gran parte del esfuerzo se invirtió en la mejora del proceso de solubilización del antígeno, ya que la proteína se expresa de forma insoluble. Como etapa inicial, se ensayaron condiciones de lavado, y se determinó que la adición del agente reductor DTT tenía un alto impacto en la obtención de proteína soluble una vez finalizado el proceso. Se ensayó con diferentes agentes de solubilización y se determinaron el uso de SDS, sarkosyl y cambio de pH en presencia de Tween 20, como las estrategias más acertadas para lograr una recuperación de proteína soluble cercana al 100%. Se evaluaron en términos de funcionalidad mediante un Dot blot, donde se determinó que pueden ser reconocidas por anticuerpos comerciales. También se evaluó la capacidad que posee la filtración tangencial de sustituir la centrifugación en la etapa de separación y lavado de los CI, obteniendo un desempeño comparable. Finalmente se iniciaron los ensayos de estabilidad natural de la proteína, donde se comprobó que la proteína libre de cisteínas evita la formación de multímeros por al menos cuatro meses.Item Electroporación de CRISPR-Cas9 en cigotos murinos(Universidad ORT Uruguay, 2019) Elenter Litwin, Nicole; Crispo, Martina; Mulet Navarro, Ana Paula; Abreu Olano, Cecilia; Badano Caballero, José LuisCRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) y los genes asociados a CRISPR (Cas) son elementos esenciales del sistema inmune adaptativo de algunas bacterias y arqueas, al intervenir en la eliminación de material exógeno invasor. El sistema tipo II de CRISPR es la herramienta más utilizada para la edición génica, permitiendo la obtención de diversos modelos animales. El ratón de laboratorio (Mus musculus) es el animal de investigación por excelencia. La generación de modelos murinos genéticamente modificados mediante la técnica de CRISPR implicaba necesariamente la microinyección de material exógeno en los ovocitos. Esta técnica presenta ciertas desventajas: personal altamente calificado, un trabajo laborioso y lento, causando la muerte de la mitad de los embriones. Como alternativa a la microinyección surge la electroporación. Esta implica la generación de poros en la membrana de los cigotos mediante la aplicación de pulsos cortos. A diferencia de la microinyección, la electroporación se caracteriza por su simpleza, rapidez y costos de producción bajos. Durante este trabajo se efectuó la puesta a punto de un protocolo para la generación de embriones genéticamente modificados mediante la electroporación de CRISPR-Cas9 en cigotos murinos. En primer lugar, se optimizó el tiempo de tratamiento con ácido tirodes (AT) de los cigotos. Con una solución de AT, se degradó un porcentaje de la zona pelúcida lo suficientemente alto para permitir el ingreso de las RNPs, sin ir en desmedro del desarrollo del embrión. Además, se determinó el protocolo óptimo para la generación de embriones knockout (KO) del gen Clec4F. Las condiciones óptimas seleccionadas fueron electroporaciones de 10 pulsos de 30V, con una duración de 3ms y un intervalo entre pulsos de 100ms, y concentraciones de RNPs de 250ng/μl de proteína Cas9 y 300ng/μl 5 de sgRNA. Estas condiciones fueron determinadas con embriones de la cepa híbrida de ratones B6D2F1/J, obteniéndose un desarrollo a blastocisto de 16,4% y una de eficiencia de mutación de 70,0%. Se probó que este protocolo es válido para generar embriones KO para el mismo gen en la cepa consanguínea de ratones C57BL/6J. Se obtuvo para esta cepa un porcentaje de desarrollo a blastocisto de 6,5% y una eficiencia de mutación de 85,7%. Por último, se intentó insertar un sitio loxP en embriones de la cepa híbrida. Si bien no se obtuvo una alta eficiencia de knockin (KI), se lograron resultados de desarrollo y eficiencia de mutación de KO de 41,1% y 100,0% respectivamente.